【答案】D

【解析】结合题意分析图形可知，目的基因的两端各含有一个限制酶I和限制酶Ⅱ的切点，质粒中的两个不同的标记基因中也分别含有一个限制酶I和限制酶Ⅱ的切点，且限制酶I的识别序列内部含有限制酶II的识别序列和切点，由于构建完成的重组质粒中至少要含有一个标记基因不能被破坏，因此质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割，才能符合要求，故D正确，ABC错误。